Gram Negatif Bakterilerin İdentifikasyonu

Tüm gram negatif bakteriler, mikroskopta genellikle pembe renkli küçük çubuklar şeklinde görünürler.

Gram negatif bakterilerin tür tespitinde başvurulabilecek 5 yol vardır:

1. Karbonhidrat fermentasyon testi
2. SIM Test (Hidrojen-Sülfit, İndol, Motility (Hareket))
3. Sitrat testi
4. Phenylalanine Deaminase (PA)Testi
5. Ürease Testi

Gram negatif bakteriler genellikle, Mac Conkey Agar’da kültüve edilirler. Bu besiyeri, gram-pozitif bakterileri inhibe etmek amacıyla safra tuzları ve kristal viole içermektedir. Yine agarın içindeki laktoz ve nötral red boyası, pH değişikliğini gösterir. Laktoz pozitif koloniler, kırmızı-pembe görünür.

 

Karbonhidrat Fermentasyon Testi:

· Genellikle pH indikatörü olarak fenol red içeren bir brot ile yapılır

· Bu brotlar Phenol Red Broth veya Lactose Red Broth olabilir.

· Mikrorganizmanın karbonhidratı fermente etmesi sırasında oluşan gaz çıkışını gözlemleyebilmek için, test tüplerinin içine Durham tüpleri de konulmuş olmalı.

· Mikroorganizmanın laktozu glukoza ve galaktoza çevirebilmesi için beta-galaktosidaz içermesi gereklidir.

· Organizma basit şekerleri fermente ettiğinde, asidik son ürünler ortaya çıkar. Bunlar daha düşük pH değerlerindedirler ve brotun rengini sarıya değiştirirler.
 
Test sonucunda:

1. Negatif : Kırmızı brot – fermentasyon yok

2. A/G Pozitif: Asit ve Durham tüplerinde gaz çıkışı var ve brotun rengi sarıya dönmüş

3. Asit pozitif: Besiyerinin rengi sarıya dönmüş; fakat gaz çıkışı yok.
 
SIM Testi:

· Öze ile alınan kültür SIM Agar’a direkt batırma yoluyla inokule edilir.

· SIM Medium, aminoasitleri metabolize edebilen mikroorganizmaların tespitinde kullanılır.

· SIM medium ile 3 ayrı test yapılır

>>> Hidrojen Sülfit (H₂S)

Cystamin ve Metathiamine sülfür içerir. Organizma bunları metabolize edebilirse, hidrojen oluşumu gerçekleşir.§ Agardaki kurşun nitrat hidrojen sülfiti tutar, kurşun sülfit oluşumuna bağlı olarak siyah bir çökelme meydana gelir. Hidrojen sülfit pozitif durumlarda agar, siyah renk alır.

Negatif durumda, besiyeri renginde değişiklik olmaz.

>>>İndol

Aromatik aminoasit triptofan, besiyeri içerisinde bulunmaktadır. Bakteri bu amino grup molekülünü ve indolü kırabilirse, test pozitif sonuç verir.

Bakteri gelişmesini tamamladıktan sonra, Kovac’s ayıracı indol ile reaksiyona girecek ve tüp yüzeyinde parlak kırmızı bir halka oluşturacaktır.

Test negatif ise, kovac’s ayıracı eklendiğinde renkte bir değişiklik olmaz.

>>> Motility (Hareket)

Organizma hareketliyse, ekim hattının dışına taşar ve mediumda bulanıklık oluşturur.

Eğer hareket negatifse, üreme, ekimin yapıldığı hat üzerinde kalır.
 
Sitrat Testi:

Tüpte yatık agar şeklinde hazırlanmış, yeşil renkli sitrat agarın yüzeyine bakteri ile eğik çizme ekimi yapılır.

Sitrat Agar, bir trikarboksilik asit olan sitrik asit ve Brom Cresol Agar içerir.

Sitrat permeazlı bakteriler sitrik asidi yükseltgeyerek alkalin son ürün oluşumuna yol açarlar. Bu da pH değişikliğine yol açarak, besiyerinin rengini maviye çevirir.

– Test pozitifse, renk maviye döner.
– Test negatifse, besiyeri yeşil kalır.
 
Phenylalanine Deaminase (PA) Testi:

Bakteri kültürü yatık agar yüzeyine sürülür.

Phenylalanine aromatik bir aminoasittir.

Eğer bakteri phenylalanine deaminase’ı tutarsa, amino grubu uzaklaştırabilir; geriye phenylpyruvic asit kalır.

Testi tamamlamak için, agar yüzeyine %5’lik ferik klorid solusyonu eklenir.

Eğer test pozitifse, agar yüzeyi zeytin yeşiline döner.

Eğer test negatifse, herhangi bir değişiklik olmaz.

Proteus ailesi üyeleri bu teste genellikle pozitif sonuç verirler.
 
Urease Testi:

Test için kullanılan medium, düşük konsantrasyonda fenol red indikatörü içeren, turuncu renkli Urea Broth’dur.

Normalde zehirli bir madde olan üre, aminoasit metabolizmasının en son ürünüdür. Bazı organizmalar ürease içerebilirler; bu da üreyi, karbondioksit ve ammonia formunda parçalamalarını sağlar. Ammonia su ile reaksiyona girerek ammonium hydroxide oluşturur.

Eğer test pozitifse, ammonium hydroxide oluşumuna bağlı olarak, brot kırmızı renk alır.

Eğer sonuç negatifse, brotun kendi rengi olan turuncu renk değişmez.

Süt Tozundan Kazein Eldesi Deneyi ve Raporu

DENEYİN ADI: Süt tozundan kazein eldesi

DENEYİN AMACI: Süt tozundan kazein eldesi ve kuru süt tozundaki kazein yüzdesinin hesaplanması

TARiH:07.03.2008

TEORİK BİLGİ:

Süt tozu; ham sütteki suyun tamamına yakını buharlaştırıldıktan sonra, yoğunlaşmış kuru maddenin toz haline getirilmesi ile elde edilen dayanıklı ve besin değeri çok üstün bir süt mamulüdür. Süt tozu protein olarak bilinen kazein, şeker olarak bilinen laktoz, albümin proteini ve bazı gliseridler (tereyağı) içerir.

Kazein, genel olarak süt proteini olarak bilinir. Böyle denmesinin sebebi, sadece sütte bulunması ve sütün en büyük protein kısmını oluşturmasından ileri gelir. Sütün içerisinde yüzlerce protein olmasına rağmen, kazein yüzde 80 gibi bir paya sahiptir. Kazein, süt içerisinde fosfoprotein yapısındaki bir kalsiyum tuzu olarak karşımıza çıkar.
Yapısında, çokça etkileşime girmemiş prolin peptitleri vardır. Ayrıca kazein yapısında disülfit bağlarının olmaması sonucu, ikincil ve üçüncül protein yapısı küçüktür. Bu yüzden de denatüre olamaz.
Kazein saf bir protein olmayıp alfa, beta, gama kazein diye adlandırılan birbirine benzeyen en az üç protein bileşeninden oluştuğu elektroforezle gösterilmiştir.
Kazein, sıcaklık ile pıhtılaşmayan bir yapıya sahiptir. Kazeinin çökmesi ortam ph ‘sına bağlıdır. Asitide yükseldikçe kazeini çöktürmek için gereken sıcaklık da düşer. Isıtmakla asidite de kendiliğinden artar.
Kazein, asetik asit (sirke) gibi yaygın asitlerin eklenmesi ile ph’sının düşürülmesi yöntemiyle ve ineklerin midelerinden elde edilerek peynir yapımında kullanılan rennet enzimiyle pıhtılaştırılabilir.
İlk işlemin mekanizması şu şekilde açıklanabilir: kesilmiş süt proteini olan kazein, misel olarak adlandırılan bir demete bağlanmış birçok bileşik içerir. bir protein alt ünitesi her bir miseli stabilize ederek, süt içerisinde dağılmış halde kalmasını sağlar. Asitleşmede, koruyucu protein alt üniteleri dengesizleşir ve misellerle birlikte pıhtılaşabilir, bu da sütü kesilmiş/pıhtılaşmış yapar. Kimyasal olarak, kazein miseli stabilize değildir ve bundan dolayı, izoelektrik noktadaki izoelektrik yükteki düşüş ile kümeleşme gerçekleşir. Bu esnada, ortamın asitliği minerallerin çözünürlüğünü artırır, böylece misel yapıda bulunan organik kalsiyumun ve fosforun büyük kısmı sıvı fazda çözünür duruma gelir. Kazein miselleri parçalanır ve küme oluşumu ile kazein çöker.
Kazein sütten asit ilavesi ile izoelektrik noktası ph:4,6’da veya süt kendi kendine ekşidiği zaman da kazein yavaş yavaş çöker. Kazein sütten asitle izoelektrik noktaya ulaşınca çökerken, rennin ilavesiyle kazein izoelektrik noktaya varmadan nötral (ph = 7) noktada parakazein durumunda çöker.
Kazein, hidrofobik bir yapıya sahiptir. Bu yüzden kazein miselleri, sütte bir süspansiyon halinde bulunurlar. Hidrofobik olması, kazeinin suda ve nötral tuz çözeltilerinde çözünmemesine, sodyum oksalat  ve sodyum asetat gibi tuz çözeltilerinde ve bazik çözeltilerde ise çözünmesine sebep olur.

VERİLER:

Süt tozu: 20 gr.

Süzgeç kağıdı: 3,1 gr.

Süzgeç kağıdı + kazein: 13,3 gr.

Kazein: 10,2 gr.

YORUM:

20 gr. süt tozu kullanılarak 50ml çözelti hazırlandı. Su banyosunda 40C ‘ye kadar ısıtılmış süt çözeltisi üzerine yavaş yavaş 20ml  % 10luk asetik asit çözeltisi ilave edildi. Ve yavaş yavaş karıştırıldı. Bu işlemi yavaş yapmamızın sebebi büyük miktarda sakızımsı kazein kütlesi elde etmektir. Eğer işlemi hızlı yaparsak kazein küçük partiküller halinde oluşur. Bu da sütten zorlukla ayrılır.

Kazein, sıcaklık ile pıhtılaşmayan bir yapıya sahiptir. Kazeinin çökmesi ortam ph ‘sına bağlıdır. Asitide yükseldikçe kazeini çöktürmek için gereken sıcaklık da düşer. Isıtmakla asidite de kendiliğinden artar. Süt çözeltisi üzerine eklenen asit çözeltisi ve su banyosu bu işlemleri gerçekleştirmemizi sağladı.

Kazein, misel olarak adlandırılan bir demete bağlanmış birçok bileşik içerir. Asetik asit ilavesi bu misellerdeki negatif yükleri nötürleştirir. Serbest protein oluşmasına neden olur. Ve kazeinin çökmesine yardımcı olur.

Sütün içerisinde yüzlerce protein olmasına rağmen, kazein yüzde 80 gibi bir paya sahiptir. Bizim deneysel sonucumuza göre 20 gr süt tozundan 10,2 gr kazein elde edildi. Buda % 51 demektir. Deneyimiz başarıyla sonuçlanmıştır.

Laboratuvarda Gerekli Tablolar ve Bilgiler

[gview file=”http://www.e-kimya.com/wp-content/uploads/merck-pdf/17691.ProNet.pdf”]

Merck size, kimyasallarla çalışırken ihtiyacınız olan tüm bilgileri içeren tablolar sunuyor. Dahası, tek bir pdf-kitapçıkta derlenen tablolarımız, laboratuarınızda temel kuralları, kolay ve kapsamlı bir şekilde iletmenize yardımcı olur.

Kitapçığımız, risk ve güvenlik ibarelerine, elementlerin kimyasal ve fiziksel özelliklerine, elementlerin tayini için fiziksel yöntemlere, çözeltiler hakkında bilgilere, indikatörlere ve tamponlara ya da kütle ve ağırlığa yönlendiren, birçok bölüme ayrılmıştır. İçerideki tabloları kullanarak, günlü işlerinizi kolaylaştıracak ve daha fazla netlik ve güvenlik elde edeceksiniz.

Size personelinizi bilgilendirmek için elverişli ve temel bilgi, kısa bir kullanıcı rehberi, ve kimyasalları kullanma ve onlarla çalışma konusunda açık bilgi sunuyoruz.

Kitapçığı indirmek için tıklayınız.

Merck İnce Tabaka Kromatografisi (TLC/HPTLC)

İnce Tabaka Kromatografi konusunda pazar lideri olarak, güvenilir TLC/HPTLC plakalarda 30 yılı aşkın süredir standartları belirliyoruz. Sadece uzmanlığımıza güvenmekle kalmıyor aynı zamanda üretim proseslerimizi ve kalite kontrolü sürekli olarak geliştiriyoruz.
Merck’in TLC/HPTLC kalitesi, literatürde Merck plakaları ile yapılmış sayısız TLC/HPTLC uygulaması ile kanıtlanmış şekilde ünlüdür.

Yeni TLC videosunu izleyin ve TLC/HPTLC plakaların dünya lideri kalitesini nasıl elde ettiğimizi görün.

[flv]http://www.merck-chemicals.com.tr/is-bin/intershop.static/WFS/Merck-TR-Site/Merck/tr_TR/topic/movies/TLC/tlc_en.flv[/flv]